Получение костного мозга патент

Путем трансплантации стволовых клеток лечат остеопороз (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), аллергические заболевания (Патент РФ №2250773 от 27.04.2005), паркинсонизм (Патент РФ №2259836 от 10.09.2005), травму головного мозга (Патент РФ №2216336 от 20.11.2003), онкологические заболевания (Патент РФ №2257219 от 27.07.2005) и иные болезни. Стволовые клетки подразделяются на мезенхимальные (они способны дифференцироваться в клетки тканей мезодермального происхождения), гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной системы) и другие. ЕД/мл. Полученную смесь наслаивают на раствор HISTOPAQU-1077 (SIGMA diagnostics) и центрифугируют в течение 30 мин с ускорением 400G и температуре 18-22°C.

Получение костного мозга патент

Важноimportant
Воловой (72) Автор(ы):Волова Лариса Теодоровна (RU) (73) Патентообладатель(и):Волова Лариса Теодоровна (RU) (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КРУПНОБЛОЧНЫХ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ КОСТНЫХ ИМПЛАНТАТОВ (57) Реферат: Изобретение относится к медицине и биотехнологии. В предварительно механически обработанных, отмытых проточной водой крупных костных блоках, состоящих из компактного и губчатого компонентов костной ткани, делают хаотически расположенные сквозные отверстия диаметром 1-3 мм.

После воздействия на крупноблочные костные имплантаты липосистемами и перекисью водорода воздействуют на крупноблочные костные имплантаты низкочастотными ультразвуковыми колебаниями частотой 35±10% кГц в течение 1-3 минут. Помещают крупноблочные костные имплантаты в камеру, в которой создают вакуум с остаточным давлением 1-2 Па на 15 минут.

Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования

Вниманиеattention
Однако количество этих клеток в костном мозге человека не превышает 0,15-0,5%. Исходя из вышеизложенного, становится понятным, что стимуляция пролиферации недифференцированных клеток костного мозга в условиях ex vivo, способных к последующей дифференцировке в организме пациента весьма актуальна.

Известен способ повышения пролиферации недифференцированных клеток костного мозга (патент RU № 2360965), основанный на использовании смесей, содержащих цитокины, которые стимулируют пролиферацию клеток, и ингибиторы, подавляющие их дифференцировку, как равнозначные агенты стимуляции роста клеток. Использование ингибиторов в указанном способе является существенным недостатком, т.к.

Получение костного мозга

Патент», г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Предложенный способ позволяет не только увеличить выход количества гемопоэтических островков, но и значительно улучшить качество препарата за счет получения сохранных клеток костного мозга. Полный выход клеток из костного мозга позволяет получить картину истинного содержания клеток кроветворной системы в костном мозге, что важно при изучении кроветвореФормула изобретения 5 Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования путем их вымывания иэ костной ткани, инкубацией в среде, содержащей раствор коллагенаэы, с последующей механической разбивкой и 10 фиксацией, отличающийся тем,что,сцелью увеличения выхода клеток, костный мозг после инкубации дополнительно обрабатывают 0,2-0,3-ным раствором трипсина в течение 30 — 45 мин, при этом для 15 инкубации используют 0,1-0,2 6-ные растворы коллагенаэы.

Под инвертированным микроскопом оценили эффективность отмывки по количеству оставшихся в суспензии клеток (гемопоэтических клеток). В матрас для культивирования добавили подогретую до +37°С среду культивирования (80%, ДМЕМ, 20% сыворотки плодов коровы), объем 12 мл, после чего матрас поместили в СО2 инкубатор на 3 дня.


За ростом культуры наблюдали ежедневно, осуществляя кормление культуры путем замены 6 мл кондиционированной среды на 6 мл свежеприготовленной. На 3-й день культивирования с помощью инвертированного микроскопа оценили проективное покрытие матраса клетками первичной культуры костного мозга. Высокие требования к соматическому состоянию обуславливают дефицит доноров-добровольцев и противопоказания к аутодонорству у некоторых групп пациентов.

Инфоinfo
Образец с костным мозгом поступает в стерильных 50 мл пробирках с 15 мл гепариновой воды, полученной разбавлением дозы 5 мл гепарина в 200 мл физиологического раствора. Все процедуры по выделению концентрата стволовых клеток проводят в подготовленных продезинфицированных от бактерий помещении и аппаратуре посредством освещения ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 15-20 минут и протиркой салфеткой, смоченной 70% раствором этилового спирта, поверхностей ламинарного бокса, в котором приготавливают ростовую среду путем добавления к 45 мл среды МЕМ-α либо Advanced Stem Cell Media 5 мл фетальной коровьей сыворотки с концентрацией не менее 10%, прогревая ее до температуры 37°С, т.е.

эта среда, в которой должны расти МСК. Чтобы костный мозг был не столь густым, его разбавляют раствором Хэнкса в 1,5-2 раза в зависимости от его густоты.

Собирают слой мононуклеарных клеток с границы раздела фаз и отмывают с 20 мл гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД/мл трехкратным центрифугированием по 10 мин с ускорением 400G и температурой 18-22°С. Недостатками указанного выше способа являются: большое процентное — 10% — количество лидокаина в качестве местного анестетика обладает токсичностью, может вызвать аллергические реакции, судороги, резкое снижение артериального давления, при этом способе не проводят анализы на инфецировонность, биологический посев, т.е.способ травматичен.

Кроме того, способ нетехнологичен, проводится в лабораторном режиме, для промышленного применения не отработан. Выращивают клетки посевом во флаконы. Клетки получают однородными, с высоким выходом, клетки жизнеспособны.
Выход 106/1 г ткани.
Москва от 14.06.72) и по предлагаемому способу с использованием ультразвуковых колебаний и вакуума. Нативный материал был изучен микроскопически. Полутонкие срезы, полученные с замороженной декальцинированной костной ткани, окрашивали Суданом III.

Также окрашивали полутонкие срезы метиленовым синим в растворе буры, гематоксилинэозином и пикрофуксином. На препаратах нативной костной ткани костный мозг занимает все межтрабекулярное пространство, а жировые включения, которые составляют 50% и более костного мозга, сливаются в крупные конгломераты между костными балками.

На микропрепаратах кости, отмытой по известной методике, фрагменты костного мозга имеют меньшие размеры и их количество незначительно.
Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителями, не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявляемого способа изготовления крупноблочных лиофилизированных костных имплантатов преобразований на достижение технического результата. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Критерий изобретения «промышленная применимость» подтверждается тем, что предлагаемый способ изготовления крупноблочных лиофилизированных костных имплантатов может быть успешно использован в отделениях по заготовке биопластических материалов, предназначенных для использования в реконструктивных операциях в травматологии, ортопедии, стоматологии как самостоятельные имплантаты, так и полученные из них крошка, цилиндры, полоски и т.д.
В медицинской практике известно решение метода выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга перед культивированием, см. статью авторов: В.И.Шумаков, ЭН.Казаков, Н.А.Онищенко, С.В.Гуреев, Е.Н.Остроумов, В.В.Честухина, М.Е.Крашенинников, Б.Л.Миронков. А.Ш.Хубутия «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции мокарда», «Российский кардиологический журнал» №5 (43) 2003 г., с.42-50. Из различных направлений клеточной трансплантации наиболее перспективным является трансплантация прокультивированных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из костного мозга. Эти клетки, будучи аутологичными для реципиента, устраняют необходимость иммуносупрессивной терапии.

В соответствии с «Инструкцией по заготовке и консервированию посмертного костного мозга Министерства здравоохранения СССР» от 1989 миелоаспирацию у донора-трупа проводят способом, аналогичным применяемому у доноров-добровольцев, при разрежении не более 0,4 Атм. Однако эффективность этого способа у доноров-трупов, как правило, ниже, чем у здоровых, что связанно с изменениями реологических и динамических свойств крови, наступающих при остановке сердечной деятельности.Посмертная гемокоагуляция приводит к тромбированию сосудов кости и препятствует вымыванию прогенеторных клеток из ячеек кровью.

При частичном выключении кости из кровообращения удается собрать концентрированный КМ, однако большое количество прогенеторных клеток остается не собранными. При полном прекращении тока крови в костной ткани создающееся при аспирации разряжение делает процедуру сбора не эффективной.
В соответствии с федеральным законом, изъятие органов и тканей осуществляется у доноров-трупов с бьющимся (находящихся в состоянии смерти мозга) и не бьющимся сердцем.

  • Доноры-трупы с бьющимся сердцем — доноры с констатированной смертью мозга на фоне сохраненной сердечной деятельности, подключенные к системе, обеспечивающей надлежащий уровень оксигенации тканей.
  • Доноры-трупы с не бьющимся сердцем — доноры с констатированной биологической смертью.

1. Оценка пригодности донора-трупа для сбора КМ. Проводится в соответствии с действующими на территории РФ нормативно-правовыми актами. При оценке донора-трупа изучают анамнезы жизни, болезни, описание проводившегося лечения, условия наступления и констатации смерти, проводят внешний осмотр.